一、 甲基化DNA免疫共沉淀測序概述

甲基化DNA 免疫共沉淀測序（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing， MeDIP-Seq）先用5'-甲基胞嘧啶抗體富集胞嘧啶甲基化的基因組片斷，然后對富集的片段進行高通量測序。該方法檢測范圍覆蓋全基因組，所需測序數據量較少，但不能在單堿基分辨率水平上檢測DNA胞嘧啶甲基化狀態。

二、 甲基化DNA免疫共沉淀測序研究內容

• 全基因組不同水平甲基化區域的分布：分析MeDIP-Seq 讀序在全基因組、不同功能元件區域（CpG 島、重復序列、啟動子、非翻譯區、外顯子、內含子和基因間等）的分布情況。識別序列富集峰（peak）。結果可顯示不同樣本間DNA甲基化修飾模式的差異。
• 基于富集峰的基因功能及其調控機制的預測：對于單個樣本，分析與peak相關的基因；對于多樣本，進行基于peak 的全基因組甲基化差異分析。通過分析差異甲基化區段（DMR），對差異基因進行GO功能富集分析及pathway功能分析；也可結合表達譜數據，預測受甲基化調控的基因。

研究流程示例

三、 甲基化DNA免疫共沉淀測序實驗技術路線

MeDIP-Seq實驗流程

四、 樣品要求（基因組DNA）

樣品純度：OD 260/280值應在1.8～2.0 之間；RNA 應去除干凈。
樣品濃度：最低濃度不低于50ng/ul。
樣品總量：每個樣品總量不少于10ug。
樣品溶劑：溶解在H20或TE (pH 8.0)中。
樣品運輸：DNA低溫運輸（-20℃）；且在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現污染。

五、 甲基化DNA免疫共沉淀測序數據分析流程

六、 MeDIP-Seq數據分析內容

1. 測序數據質量控制

包括：總reads數、總base數，Q20比例、Q20位點分布圖。

2. 測序數據預處理

包括：去除總體質量偏低的reads，將質量大于20堿基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端質量Q低于20的堿基；去除reads中所含有的接頭序列；去除長度小于20的測序片段(reads)。

3. 將預處理后的reads比對到參考基因組并統計富集效率

包括：Reads唯一比對率，在CpG島區域、啟動子區域及整個基因組的覆蓋及不同深度關系

4. 測序深度是否足夠質量控制

5. 甲基化富集效果質量控制

 

6. Peak查找和統計

應用MACS軟件對基因組mapping得到的bam文件進行peak 富集區查找，并統計長度和染色體分布。

7. Peak在CpG島、不同基因功能元件中的分布

  

8. 基于peak的樣本間差異分析

將各樣本有重疊的peak合并，統計每個樣本在合并后的peak中是否富集，統計組間差異的個數并基于RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)計算peak在組間差異是否顯著。

9. 樣本間富集程度相關性分析

 
10. 樣本間差異peak區域測序深度作圖

 
11. 全基因組甲基化圖譜

 對差異基因進行GO功能富集分析及pathway功能分析

12. 對差異基因進行GO功能富集分析及pathway功能分析

GO功能分析：

 
KEGG功能分析：

 

13. MeDIP-seq數據和表達譜數據結合分析

將MeDIP-seq數據和表達譜數據結合分析，對富集peak區域和差異表達基因進行關聯，可進行差異基因的甲基化情況聚類熱圖、不同基因區域甲基化和表達譜相關性計算和作圖。

14. 客戶定制分析 

可根據客戶的研究需求，協商定制個性化分析內容。

MeDIP-Sequencing應用案例

• PNAS：研究發現DNMT3A突變驅動了慢性粒單核細胞白血病

在20%的急性髓性白血病案例中會發生DNMT3A的突變，突變熱點為Arg882 (R882)。本研究通過運用逆轉病毒轉導及骨髓移植（BMT）的方法來研究DNMT3A-Arg882His (R882H)突變體的轉化能力。研究人員發現突變的基因能夠引起造血干細胞/祖細胞的異常增殖。BMT 1年后，所有小鼠都出現了血小板增多，且患上CMML。RNA芯片分析結果顯示一些造血作用相關基因異常表達，DNA甲基化實驗證實基因區域甲基化類型發生相應的變化（課題相關MeDIP-SEQ技術服務由上海伯豪生物技術有限公司提供）。此外，DNMT3A-R882H增加了CDK1蛋白水平，加強了細胞周期活力，這些都導致白血病的生成。上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院的陳竺院士、陳賽娟院士以及王月英博士是這篇論文的共同通訊作者。 

原文：DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression/DNA methylation in hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Feb 4.

單位介紹

•        上海伯豪生物技術有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心根據國內外研發外包發展的需要，整合旗下系統技術平臺、商業化服務體系、高素質服務團隊等資源成立的致力于研發外包服務的專業化公司。

  上海伯豪生物技術有限公司擁有六大服務平臺：生物樣品分析平臺、微陣列芯片平臺、新一代測序平臺、生物標志物平臺、分子檢測平臺、生物信息平臺，憑借高標準的技術平臺和多樣化的服務等競爭優勢，公司向國內外企業和相關單位提供系統的生物學研究全面解決方案。目前正在為多達18家跨國制藥企業（包括排名前10位的跨國制藥企業）和超過3000家的國內科研機構、醫院等提供基因表達譜、基因分型、比較基因組學、DNA甲基化、miRNA、生物標志物篩選及確認、生物信息等技術服務。 

  公司擁有一支以上海為基礎，輻射全國的強大市場營銷隊伍和銷售網絡，已設立華北、華南、華東三個大區十五個辦事處，推廣公司的主導技術服務、代理產品，快速提升公司品牌的知名度，擴大影響力。過去10年承接項目數超過10000個，用戶單位3000家以上，協助客戶發表SCI論文700余篇（影響因子共計3000多分），全面推動了中國基因組學服務產業的發展。 

  公司建立了規模化的質量控制體系，通過了ISO9001: 2008質量技術體系的認證，并參照GLP-L的標準，通過128個SOP文件對項目、樣品、實驗過程、生物信息分析過程、數據信息管理、保密等進行嚴格質控。尤其是數據管理，做到異地備份，保密管理。為用戶的數據真實性、可靠性提供了保證。

  公司的系統化技術平臺和高質量的服務體系得到了廣大客戶認可和合作伙伴的高度評價。公司平臺陸續獲得了國際知名高通量技術廠商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技術服務中心認證。公司于2012年獲得諾華（CNIBR）優秀供應商獎（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中國第一家認證的服務提供商，是Agilent公司在國內唯一認證的服務提供商，先后被授予“Agilent公司亞太區最佳服務供應商”和“Affymetrix公司優秀服務商”稱號。

  
  

單位資質

暫無信息