DNA的甲基化修飾是表觀遺傳研究中的一個熱點，在基因調控過程中扮演著重要的角色。它在維持組織特異性表達譜，使細胞獲得并保持特定狀態中起著重要作用。同時也調控著染色質穩定性、印跡基因表達調控、X染色體失活及抑制病毒和外源基因的表達等生物過程。更重要的是，在許多復雜疾病或生命過程的發生、發展中，也與DNA甲基化對基因的表達調控密切相關，這些疾病包括：癌癥、神經系統紊亂、老化以及發育。

Illumina在原450K芯片巨大成功的基礎上，推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（下文中以850K芯片代稱），為研究者提供了一個可靠且經濟高效的甲基化分析平臺。850K芯片可檢測人全基因組約853,307個CpG位點的甲基化狀態，其中包含了原450K芯片91%的位點，并增加了413,745個位點（圖 1）。850K芯片不但保持了對CpG島，基因啟動子區的全面覆蓋，還特別加強了增強子區（新增了333,265個探針覆蓋來自ENCODE及FANTOM5計劃的增強子）以及基因編碼區的探針覆蓋。廣泛應用于干細胞研究、腫瘤和其他復雜疾病研究，是目前最適合表觀基因組全關聯分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。

芯片特點

• 覆蓋全面：檢測853,307個CpG位點；全面覆蓋CpG島、啟動子、編碼區及增強子。
• 無需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亞硫酸氫鹽處理基因組DNA即可進行芯片實驗； Infinium探針設計，直接識別甲基化位點；
• 技術重復重現率>98%；
• 操作簡單，無須PCR擴增；模板量可低至250ng；
• 適用于FFPE樣品。

圖 1 Illumina Infinium MethylationEPIC (850K)芯片與450K芯片的異同

Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片對全基因組的全覆蓋

850K芯片對基因組的功能元件提供了空前全面覆蓋：CpG島、RefSeq基因、ENCODE開放染色質、ENCODE轉錄因子結合區以及FANTOM5增強子。領先的Infinium HD技術的保證了目標區域超高密度覆蓋，同時還避免了甲基化DNA捕獲方法具有偏向性的缺點。850K芯片的一大特點是增加了很多由ENCODE項目中鑒定出來的潛在增強子。（ENCODE通過全面分析開放染色質、FAIRE實驗、轉錄因子結合區域，整合出基因組中最活躍的區域。）最后，芯片還覆蓋了FANTOM5項目鑒定得到的不同組織類型中的增強子。下圖及表格統計展示了850K芯片對于不同染色體、基因組功能元件的覆蓋及分布。以上的設計不但可從泛-增強子及編碼區域角度分析甲基化組，還在全基因組表觀遺傳關聯研究（EWAS）中發揮重要作用。850K芯片中所包含的系列有價值的位點：

• CpG島以外的CpG位點
• 人類肝細胞中的非CpG甲基化位點（CHH位點）
• 腫瘤（多種類型的癌癥）VS正常樣本中的不同甲基化位點，可以檢測多種樣本類型
• FANTOM5增強子
• ENCODE開放染色質和增強子
• 脫氧核糖核酸酶超敏位點
• miRNA啟動子區域
• 涵蓋Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中的＞90%的內容

圖 2 850K芯片探針在不同染色體及基因組功能元件中的分布。

芯片數據的可靠性

Methylation EPIC BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探針設計（Figure 4）,以達到保證數據穩定可靠的同時也達到對目標區域全面覆蓋。Infinium II探針對目的CpG位點采用單個探針且序列中包含簡并堿基設計，即使序列中有多達三個CpG位點的甲基化狀態影響也不會對目的位點的結果造成影響。Illumina的科學家嚴格檢測每個產品，以確保強大而重復的性能，讓研究人員能夠實現行業領先的數據質量。

（1）Infinium Ⅰ 探針設計

在InfiniumI設計中對于每個甲基化位點，都對應設計有兩種探針：M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部為G，用來檢測甲基化位點（C）。U型磁珠尾部為A，用來檢測未甲基化位點(T)。根據單堿基延伸的原理，僅當探針最后一個堿基與模板配對時，熒光標記的核苷酸才能摻入并被檢測到熒光信號。通過分析M型與U型磁珠熒光信號的結果計算甲基化值。

（2）Infinium Ⅱ 探針設計

Infinium Ⅱ 探針只使用一種磁珠，探針末端為C，與目的位點的前一個堿基配對，只延伸一個堿基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）分別與非甲基化或甲基化位點配對。根據兩種熒光類型及計算目的位點的甲基化程度。

基于Infinium平臺的可靠性，850K芯片表現出非常完美的重復相關系數（r2＞0.98），而且850K芯片與450K芯片相同的位點的重復r2＞0.98，為850K與450K數據的整合分析建立了基礎。此外通過比較8個生物學樣品的重復的結果，850K芯片能可靠檢測0.2的delta-beta值，且假陽性率低于1%。此外，芯片中設計了樣品依賴和樣品不依賴的內參以保證數據的高質量，例如專為亞硫酸氫鹽轉化后而復雜度降低序列而設計的陰性對照。

圖 3 EPIC芯片自身技術重復間的相關性以及與450K相同探針間的相關性R方都在0.98以上。

850K芯片適用于FFPE樣品的甲基化研究

 Illumina為FFPE樣本的檢測改進了protocol，以獲得更可靠成穩定的結果。通過與新鮮樣本的比較，可見雖然FFPE樣本的檢出率受到樣本質量的影響而下降，但FFPE樣本的技術重復的相關性R平方仍然高達0.98。對同一份樣本的冰凍樣本及FFPE樣本的結果比較發現兩者相關依然很高（R=0.994）。

圖 4 850K芯片用于FFPE樣本時的技術重復相關性（R2>0.98）及檢出率(>90%)；相同標本分別用FFPE處理與冰凍效果相比，重復相關性（R=0.994）。 

樣本要求

樣品類型：組織、細胞、基因組DNA

• 樣品純度：OD 260/280值應在1.7～2.0 之間；RNA 應該去除干凈；不得有其它個體或其它物種的DNA污染。
• 樣品濃度：濃度不低于50ng/μl；
• 樣品總量：每個樣品總量不少于2μg 。
• 樣品溶劑：溶解在TE中。
• 樣品運輸： DNA低溫運輸（-20℃）；在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現污染。

數據分析

 詳細內容同450K數據分析內容，

詳見鏈接：http://www.shbio.cn/product/30.html

單位介紹

•        上海伯豪生物技術有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心根據國內外研發外包發展的需要，整合旗下系統技術平臺、商業化服務體系、高素質服務團隊等資源成立的致力于研發外包服務的專業化公司。

  上海伯豪生物技術有限公司擁有六大服務平臺：生物樣品分析平臺、微陣列芯片平臺、新一代測序平臺、生物標志物平臺、分子檢測平臺、生物信息平臺，憑借高標準的技術平臺和多樣化的服務等競爭優勢，公司向國內外企業和相關單位提供系統的生物學研究全面解決方案。目前正在為多達18家跨國制藥企業（包括排名前10位的跨國制藥企業）和超過3000家的國內科研機構、醫院等提供基因表達譜、基因分型、比較基因組學、DNA甲基化、miRNA、生物標志物篩選及確認、生物信息等技術服務。 

  公司擁有一支以上海為基礎，輻射全國的強大市場營銷隊伍和銷售網絡，已設立華北、華南、華東三個大區十五個辦事處，推廣公司的主導技術服務、代理產品，快速提升公司品牌的知名度，擴大影響力。過去10年承接項目數超過10000個，用戶單位3000家以上，協助客戶發表SCI論文700余篇（影響因子共計3000多分），全面推動了中國基因組學服務產業的發展。 

  公司建立了規模化的質量控制體系，通過了ISO9001: 2008質量技術體系的認證，并參照GLP-L的標準，通過128個SOP文件對項目、樣品、實驗過程、生物信息分析過程、數據信息管理、保密等進行嚴格質控。尤其是數據管理，做到異地備份，保密管理。為用戶的數據真實性、可靠性提供了保證。

  公司的系統化技術平臺和高質量的服務體系得到了廣大客戶認可和合作伙伴的高度評價。公司平臺陸續獲得了國際知名高通量技術廠商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技術服務中心認證。公司于2012年獲得諾華（CNIBR）優秀供應商獎（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中國第一家認證的服務提供商，是Agilent公司在國內唯一認證的服務提供商，先后被授予“Agilent公司亞太區最佳服務供應商”和“Affymetrix公司優秀服務商”稱號。

  
  

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